DNA甲基化(DNA methylation)

DNA甲基化(DNA methylation)是基因调控的手段之一，在维持细胞正常功能、传递基因组印记、胚胎发育、肿瘤发生等方面起着至关重要的作用，更是表观遗传学研究的热点。全基因组甲基化测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）作为甲基化测序的“金标准”，对有参考基因组的物种在全基因组水平进行全面、高效、高准确度的甲基化研究，从而构建单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化水平图谱。

哺乳动物DNA甲基化主要为CG型，而富含CpG二核苷酸的CpG岛常位于转录调控区附近，与56%的人类基因组编码基因相关。Agilent公司推出的CpG岛精准甲基化测序，采用SureSelect系统进行靶标富集，全面覆盖基因组中最具表观遗传学研究意义的区域，极大提高测序数据有效性，达到单碱基分辨率，同时降低成本，缩短测序时长，实现多样本实验。

A workflow for Bisulfite Sequencing

我们的优势

1. 精准覆盖：采用SureSelect靶标富集系统，可覆盖370万CpG，包括CpG岛、GENCODE启动子、癌症以及组织特异性DMR等，对具有生物学意义的甲基化位点实现全面覆盖；

2. 高深度：只需10Gb数据可达100×覆盖深度，是普通测序深度的3倍，极大提高了对低频甲基化位点的探测率；

3. 高灵敏度：采用Bisulfite转化前捕获，对甲基化和非甲基化均等捕获；单碱基分辨率，可精准检测每个胞嘧啶的甲基化状态；

4. 低成本、高效率：使用液体捕获技术，大大提高捕获效率；同时靶标区域的选择策略可降低成本，得以实现多样本快速实验；

样本要求

组织样品≥50mg

DNA样品

1. 请提供总量≥3μg/样本，浓度≥100ng/μL的DNA；

2. OD260/280介于1.8-2.0之间；

3. 电泳检测无明显RNA污染，基因组条带清晰、完整，无降解；

4. 送样时请标记清楚样品编号，管口使用Parafilm膜密封；

5. 样品保存期间切忌反复冻融；

6. 送样时请使用干冰运输。

注：不同样品之间存在差异，详情请向我们咨询

实验流程

1. DNA提取及质控：凝胶电泳质控→Nanodrop质控→Agilent 2200质控；

2. DNA超声片段化：片段化后，末端修复加A，并连接甲基化接头；

3. SureSelect靶向捕获：单链RNA探针杂交进行液相捕获；

4. Bisulfite转化：靶向捕获之后进行BS转化，降低甲基化偏好性和DNA损伤；

5. 加接头扩增：捕获之后进行PCR扩增文库构建，降低PCR偏好性；

6. 上机测序：我们建议选择NovaSeq，双端测序，通量大，碱基精度高，而且成本低，速度快。数据量：10G。

数据分析流程

结果示例

1、原始数据质量控制针对过短序列，污染序列，尾端低质量序列，进行下机原始数据（Raw Data）的过滤，并采用Fastp对于过滤前后的数据进行质控，得到碱基质量，GC含量，长度分布等分析结果。图1部分展示Raw Data的质量控制结果。

碱基质量结果图

注：左图横坐标代表碱基位点，纵坐标代表碱基质量值，不同颜色曲线代表不同碱基在每条read上的质量值；右图横坐标代表碱基位点，纵坐标代表碱基含量比值，不同颜色曲线代表不同位点各碱基含量。

2、序列比对（DNA Mapping）采用Bismark等软件将过滤后的数据链特异性地比对到参考基因组上，得到5mC的甲基化类型、状态、比例，用于后续甲基化水平、分布及差异甲基化分析。采用Samtools工具，对于基因组比对文件，进行排序并建立索引。

比对流程

注：该图为Bismark比对原理图

3、甲基化水平及分析采用Bismark算法对5mC鉴定分析结果进行甲基化类型、水平和分布的分析，得到在不同样本中的甲基化类型、水平及其基因组上的分布情况。

CpG位点在基因组上的分布

Li J et al., Genome Research. 2019

注：该图对比了GPS和WGBS检测出的CpG位点在基因组上的分布情况

4、样本相关性、聚类、PCA分析以每一个样本的5mC鉴定分析结果为研究对象，采用PCA降维算法，Pearson相关性系数，K-Mean聚类等多种算法，对于每一个甲基化测序样本的甲基化程度以及样本相关性进行描述，得到样本的关联结果。

多样本间甲基化相关性分析

Wan et al., Sci Rep. 2016

注：该图展示了罗非鱼骨骼肌雌雄两性间CpG甲基化的Pearson相关性

5、差异甲基化区域（DMR）筛选以每一个样本的5mC鉴定分析结果为研究对象，采用Methykit算法，对于差异甲基化区域进行分析，得到不同样本间差异的甲基化区域。

CIRCOS：差异甲基化区域

Yizan Ma et al., Plant Cell. 2018

注：通过绘制可视化Circos图，展示了常温（NT）和高温（HT）处理对不同品系棉花（84021和H05）花药不同时期DMR在染色体上的分布情况

6、DMS/DMR相关基因分析依据DMR注释获取DMR相关的基因群，然后针对该基因群进行相关基因群的GO、KEGG Pathway和PPI分析。

DMR相关基因群PPI分析

注：基于DMS/DMR注释基因的GO条目和Pathway条目，我们可以根据其上下级调控关系绘制GO-Tree和Pathway-Act-Network，并基于STRING数据库进行PPI分析

1、差异甲基化区域（DMR）注释采用ChipSeeker算法，对于差异甲基化区域进行注释分析，得到DMR对应的基因以及所在的基因结构，包括启动子、外显子、内含子、基因间区等。

不同样本CG-DMR的基因组分布

Rizzardi LF et al., Nat Neurosci. 2019

注：该图通过聚类分析展示了不同Cell type和neuronal中的CG-DMR在基因组结构上的分布情况

文献示例

[1] Ai T, et al. DNA methylation profile is associated with the osteogenic potential of three distinct human odontogenic stem cells. Signal Transduct Target Ther. 2018. Jan 12;3:1.

[2] Liu H, et al. Integrative analysis of DNA methylation, mRNAs, and small RNAs during maize embryo dedifferentiation. BMC Plant Biol. 2017 Jun 15;17(1):105.

[3] Fang X, et al. Comparative genome-wide methylation analysis of longissimus dorsi muscles between Japanese black (Wagyu) and Chinese Red Steppes cattle. PloS One. 2017 Aug 3;12(8):e0182492.

[4] Wang Z, et al. Decreased Methylation Level of H3K27me3 Increases Seizure Susceptibility. Mol Neurobiol. 2017 Nov;54(9):7343-7352.

[5] Cheng J, et al. SUMOylation of MeCP2 is essential for transcriptional repression and hippocampal synapse development. J Neurochem. 2014 Mar;128(6):798-806.