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5+非肿瘤免疫套路分享一篇2020年发表于J Transl Med的文章，题目为《Identifying the pattern of immune related cells and genes in the peripheral blood of ischemic stroke》，IF=5.531 缺血性脑卒中外周血免疫相关细胞和基因的鉴定 摘要 背景 缺血性中风（IS）是全球第二大死亡原因，严重危害人类健康。有证据表明，免疫系统在 IS 的病理生理学中起关键作用。然而，精确的免疫相关机制仍未被系统地理解。 方法 在本研究中，我们旨在通过使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）来识别可能在IS的发生和发展中起重要作用的免疫相关模块和基因。同时，我们应用一种反卷积算法来揭示血液样本中22个免疫细胞亚群的比例。 结果 在三个基因表达综合 (GEO) 数据集中共有 128 名 IS 患者和 67 个健康对照样本。根据筛选标准，选择了 1082 个 DEG（894 个上调和 188 个下调）进行进一步分析。共确定了 11 个具有临床意义的模块，从中进一步探索了免疫相关的中枢模块和中枢基因。最后，选择 16 个基因作为真正的枢纽基因进行进一步的验证分析。此外，这些 CIBERSORT 结果表明，对免疫亚型分布模式的详细分析有可能增强临床预测并确定免疫治疗的候选者。更具体地说，我们确定中性粒细胞成为 IS 疗法的一个有希望的目标。 结论 在本研究中，我们研究了免疫相关基因表达模块，其中 SLAMF1、IL7R 和 NCF4 可能是促进缺血性中风后功能和组织学恢复的新治疗靶点。此外，这些枢纽基因和中性粒细胞可能成为药物筛选和药物设计中的重要生物学靶点。 结果 1.DEGs的数据预处理与识别 使用 ComBat 进行批量校正后，PCA 的散点图显示缺血性中风患者和健康对照样本之间存在两种显着不同的分布模式。缺血性脑卒中的样本主要分布在图的左侧，而健康对照样本主要分布在图的右侧，如图 1 所示。 将GSE58294、GSE22255和GSE16561 的样本合并为一个训练数据集，DEG 的火山图和热图如图 1C-D 所示。
图1 2.训练集质量评估与共表达网络构建 通过动态砍树方法共识别出 11 个模块，如图 2所示。临床上显着的模块被视为 p 值 < 0.05 并有资格进行进一步分析，其中包括绿松石模块、黑色模块、蓝色模块、紫色模块、绿色模块、黄色模块和粉红色模块。
图2 3.枢纽基因的鉴定 WGCNA 从共表达网络中的临床显着模块中选择了 136 个中枢基因（图 2）。通过 PPI 网络分析选择了 77 个基因（图 3）。共表达和 PPI 网络中的 16 个中枢基因被选为真正的中枢基因以进行进一步的验证分析（图 2）。
图3 4.功能丰富注释 为了进一步探索每个模块的功能，我们进行了 GO 和 KEGG 通路分析（表4和5）。 表 4
表5
5.使用数据集验证枢纽基因 验证队列由GSE37587 中的中风患者样本和GSE16561 中的健康对照样本组成。两个数据集在同一平台上使用同一芯片，使得数据合并合理。消除批次间差异后，使用标准化数据对16个枢纽基因进行验证。如图4所示。共16个基因的验证结果与多芯片联合分析一致。我们发现 ITGAM、NCF4、PAK1、PTEN、MYD88、FGR、TLR8、ATG7、MAPK1、IFNAR1、TIMP2、CANT1 和 WAS 在 IS 样品中上调，而 IL7R、SLAMF1 和 CCR7 在 IS 样品中下调。
图 4 6.免疫细胞亚型分布图谱 如图5所示。直方图显示了每个样本中各种免疫细胞的一般分布。不同的颜色代表不同类型的免疫细胞。每种颜色的高度代表样本中此类细胞的百分比，各种免疫细胞的百分比总和为1。观察到中性粒细胞、静息肥大细胞、M1和M2巨噬细胞、单核细胞、CD8 + T细胞、激活记忆 CD4 +T 细胞、γδ T 细胞和幼稚 B 细胞是主要的浸润细胞。由于CIBERSORT算法的局限性，一些低丰度表达的免疫细胞亚群在中风中的分布尚未完全揭示。两个对照组样本的免疫细胞比例呈现个体差异，对疾病和正常数据中浸润的免疫细胞进行聚类分析是发现病理过程和免疫调节机制的重要手段。如图5所示不同浸润免疫细胞亚群的比例呈弱至中度相关。例如，中性粒细胞与CD8 + T细胞的相关系数为0.63，CD8 + T细胞与幼稚CD4 + T细胞的相关系数为0.61，以此类推。与正常样本相比，中风样本通常含有更高比例的 γδ T 细胞 (p = 0.044)、巨噬细胞 M1 (p = 0.028)、巨噬细胞 M2 (p = 0.012) 和中性粒细胞 (p < 0.001)，而静息树突细胞(p = 0.001) 和嗜酸性粒细胞 (p = 0.025) 分数相对较低（图 5）。
图5 为了进一步分析hub基因表达与中性粒细胞浸润比例的相关性，我们将样本分为高比例中性粒细胞浸润组和低比例中性粒细胞浸润组。Wilcoxon检验结果表明hub基因的表达与中性粒细胞浸润比例显着相关，如图 6所示。
图6 7.临床样本验证 为了进一步验证微阵列分析的结果，我们通过 qRT-PCR 用来自 15 名 IS 患者和另外 15 名健康对照个体的血样检查了在 IS 中失调的 16 个真正中枢基因的表达。我们发现验证血液样本中有 12 个基因失调。使用 Welch 校正的非配对 t 检验对图 7 所示的数据进行统计。最后，GSE37587数据集和我们的临床血液样本中的这些基因是重叠的。其中 ITGAM、NFC4、PTEN、MYD88、FGR、TIMP2 和 CANT1 在 IS 样品中上调，IL-7R、SLAMF1 和 CCR7 在 IS 样品中下调。综合来看，尽管四个枢纽基因没有表现出显着性，但我们的实验结果与生物信息学分析结果的趋势基本一致。血常规检查结果显示，急性缺血性脑卒中患者中性粒细胞百分比升高（图7)。与疾病严重程度相关的有害中性粒细胞亚群的扩张可能通过促进全身炎症和血脑屏障的破坏而发挥重要作用。
小结 总之，我们的研究是第一个与 WGCNA 整合最全面的缺血性卒中微阵列样本的研究。在本研究中，我们展示了 7 个免疫相关基因表达模块和 16 个中枢基因，其中 SLAMF1、IL7R 和 NCF4 可能是新的候选生物标志物或治疗靶点，之前从未报道过与 IS 相关。我们的研究结果可能为进一步阐明IS的发病机制提供有价值的参考。此外，这些枢纽基因和中性粒细胞可能成为药物筛选和药物设计中的重要生物学靶点。 上一篇肿瘤生信5+新思路 |
