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教你破局！跟着3+分子分型文章学生信，快速发表你的第一篇纯生信文章摘要 Abstract 早上好，相信大家在生信科研过程中经常碰见一种情况：我研究的疾病很难找到正常样品，无论是临床取样测序还是公共数据库（说的就是你：眼科相关疾病），碰见这种情况应该怎么办？别担心，机器学习+分子分型可以拯救你。今天分享的就是一篇2021年10月份发表在Translational Andrology And Urology（IF：3.150），该思路同样适用于非肿瘤疾病。
背景&方法 Zhong Ke Sheng Xin 背景：肾透明细胞癌（ccRCC）是一种最常见的肾细胞癌类型。免疫抑制疗法，特别是PD-1是治疗ccRCC的一种主要治疗方法，目前缺乏相关生物标志物及分类模型筛选适合免疫疗法的患者。 方法： 1、ssGSEA计算免疫浸润评分； 2、利用一致性聚类（NMF）在6个数据集中识别免疫亚型； 3、两个亚型中鉴定差异基因并进行富集分析； 4、WGCNA鉴定免疫亚型相关模块及基因； 5、构建预测免疫亚型的随机森林（RF）模型； 6、免疫亚型相关潜在药物预测。
结果 Zhong Ke Sheng Xin 首先作者利用ssGSEA方法，在6个GEO数据集中计算免疫细胞富集评分（ssGSEA评分）。TCGA数据集中免疫细胞富集评分的生存分析表明，包括活化的CD4 T细胞，活化的CD8 T细胞在内的6个免疫细胞是显着的生存相关生物标志物，并且高水平患者的OS比低水平组的患者更差。 使用免疫细胞富集评分对来自六个数据集的831名ccRCC患者进行了一致性聚类。鉴定出两种主要的免疫亚型，并命名为亚型1/亚型2（图1A)。由于亚型 3 至亚型 6 中的样本数太小（图 1B），最终确定了两种主要的免疫亚型。如图 1C，1D，在OS和PFS分析中，亚型1和亚型2的生存曲线差异均有统计学意义（P=0.027和P=0.014）。亚型1患者的预后优于亚型2患者。
随后，ssGSEA评分表明，亚型2样品高度浸润先天性和适应性免疫细胞，包括B细胞，CD8 T细胞，CD4 T细胞，巨噬细胞，NK细胞和调节性T细胞（Tregs），而亚型1样品仅显示高水平的嗜中性粒细胞（图 2)。
免疫亚型间差异基因的鉴定及富集分析 共有614个DEGs在亚型2中高度表达，522个DEGs在亚型2中被定义为下调DEGs。亚型1主要富集到代谢途径包括氧化磷酸化，脂肪酸代谢，视黄醇代谢和酪氨酸代谢。亚型2主要富集到NK细胞介导的细胞毒性，T细胞受体信号通路，抗原处理和表达的免疫相关途径。 构建共表达网络 作者利用TCGA数据集和DEGs表达矩阵来构建共表达网络。基于无标度拓扑拟合指数 R2 和平均连通性 （图 3A，3B），β的最佳值为 3，因为它可以构建无缩放网络。WGCNA结果总共提供了11个不同的模块，大小从30到525个基因不等（图3C)。在这些模块中，选择了Green模块，因为它与免疫亚型具有最高的相关值（相关性=0.62;P<0.01）（图 3D)。此外，选择Blue模块，因为它与免疫亚型具有显着的负相关（相关性=−0.55;P<0.01） （图 3D)。
蛋白质-蛋白质互作网络（PPI）鉴定hub基因 Green模块和Blue模块的PPI网络从STRING数据库中单独检索，然后由Cytoscape软件可视化。随后，使用Cytoscape的cytoHubba插件从Green模块网络中选取了10个hub基因（FOXP3、CTLA4、PTPRC、CD28、CD19、LCK、CD27、CD2、IFNG和CD5）( 图4A)。同样，在Blue模块网络中鉴定出10个hub基因（AGTR1，CRP，G6PC，IGFBP1，MGAM，PCK1，PLG，REN，SLC5A1和WT1）。
构建免疫亚型分类模型（RF） 使用RF模型在IMvigor210的外部队列中进一步验证了这两种亚型。选择来自Green模块的hub基因（CTLA4、FOXP3、IFNG和CD19）来构建一个RF模型，通过基因表达来预测免疫亚型。IMvigor210包含348名接受免疫检查点抑制剂治疗（Atezolizumab）治疗的肿瘤患者。 来自TCGA数据库的患者被随机分为训练数据集（70%）和测试数据集（30%）。参数调优结果表明，2和300是"mtry"和"ntree"的最佳值，因为它们在AUC曲线（图 6A，6B)。然后使用最佳参数（mtry =2，ntree = 300）训练RF。在测试阶段，测试数据集中的 AUC 值表示预测性能良好，为 0.78 （图6C)。随后，来自IMvigor210队列的患者的免疫亚型通过四个hub基因（CTLA4，FOXP3，IFNG和CD19）的表达数据谱进行预测。亚型2的患者对Atezolizumab的总体反应率更好，约为29%，而亚型1最差的客观缓解率（ORR）约为16% （图 6D)。IMvigor210 队列中的 OS 分析结果证实，亚型 2 的患者预后优于亚型 1 患者（图 6E)。
免疫亚型相关潜在药物预测 由于免疫亚型1的患者对免疫检查点抗体的反应率可能较低，因此需要一些潜在的药物。Blue模块中的hub基因与免疫亚型呈负相关，可能是识别潜在药物的靶标。根据上述显著的生存预后结果，选取Blue模块的3hub基因（CRP、IGFBP1和WT1）进行进一步分析。DGIdb网站共提供了6个小分子、1个单克隆抗体和1个合成肽，用于靶向这些hub基因。在Discovery Studio 2019软件（一）水溶性结果显示无药物具有低水溶能力特征;（二）只有一种药物是BBB的高渗透剂;（三）所有小分子药物均为CYP2D6的非抑制剂，CYP2D6负责药物代谢；（四）ZINC150338696和ZINC169294721两种药物是基于肝毒性预测结果的无毒药物;（五）一种药物具有良好的肠道吸收水平;（六）对于PPB，预测有3种药物具有吸水性强。基于上述结果，ZINC169294721因其具有良好的水溶能力且无毒，被选为免疫亚型1患者的潜在小分子药物。
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